乳酸杆菌在儿童龋病中的作用

    　儿童龋病是常见的儿童口腔疾病之一，随着龋病的进展，龋病逐渐导致儿童的生长发育不良，包括发音障碍、营养不良、恒牙以及颌骨的生长发育异常等。而随着经济社会的发展，儿童的饮食结构和生活习惯也在发生巨大的改变，这在一定程度上影响了儿童龋病流行。儿童口腔中的致龋菌包括变异链球菌（Streptococcusmutans，S.mutans）、乳酸杆菌（Lactobacillus，LB）等产酸菌，可造成牙齿的脱矿和崩解。越来越多国内外研究表明LB与龋病的进展密切相关，本文对这些研究作一综述，为今后的口腔健康宣教和龋病防治提供依据。

  　  一、儿童龋病流行病学

   　 1995年第二次全国口腔流行病学调查结果显示，中国5岁儿童患龋率为76.55%，12岁为45.8%。2005年第三次全国口腔健康流行病学调查结果显示，5岁儿童乳牙患龋率为66%，龋均为3.5，12岁儿童患龋率为28.9%，龋均为0.5，与1995年相比儿童患龋率呈下降趋势。2005年第三次调查结果显示，广东地区5岁儿童患龋率为68.2%，龋均为4.19；12岁儿童患龋率为32.9%，龋均为0.61，高于全国平均水平。1992—1994年美国12岁儿童龋均为1.4，5~7岁儿童龋均为1.7。1986—1987年，美国国立牙科研究院（National Institute of Dental Research，NIDR）对美国进行学龄儿童龋齿患病率进行调查，发现儿童龋面均为3.07，龋均为1.97，较1979—1980年的4.77和2.91明显降低；5~9岁儿童乳牙龋面均为3.91，较1979—1980年的5.32明显下降。不同地区和国家患龋差异大，1991—2001年世界卫生组织（WHO）公布的12岁儿童龋均加拿大为2.1、丹麦为1.2、日本为2.4、英国为0.89、澳大利亚为0.8、阿富汗为2.9、中非为4.1。从目前公布的全球各国12岁儿童龋均情况来看，排在前列的国家大多数为发展中国家，这可能与经济水平、饮食结构、水含氟量等有关。

 　   二、口腔内乳酸杆菌的多样性

   　 研究报道，LB包括100多种基因型，其基因序列也表现出不同的基因组大小、GC含量、特定基因位点不同表达等。LB是包括多种基因大小在1.23~4.91Mb且GC含量为31.93%~57.02%的革兰阳性兼厌氧或厌氧菌，广泛存在于食物、水源、土壤、人类以及其他动物的口腔和胃肠道中。在LB基因分型就有100多种，常见的有11种，而在儿童口腔中，LB主要包括以下8种种类：发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、阴道乳杆菌（Lactobacillus vaginalis）、口腔乳杆菌（Lactobacillusoris）。

 　   三、乳酸杆菌的致龋作用与抑菌作用
 　   1.乳酸杆菌的致龋作用：
  　  在龋病研究史上，人类开始研究LB与龋病关系已有100多年。事实上，在S.mutans成为主要致龋病菌之前，LB一直被认为是龋病的最主要致病菌。目前，尚无相关追踪报道乳杆菌早期定植与婴幼儿龋（early childhood caries，ECC）之间有无相关关系，但乳杆菌在无龋和ECC儿童口腔中的检出有明显差异。Yang等在10个重症婴幼儿龋（severe early childhood caries，SECC）儿童口腔中检出10种乳杆菌，其中鼠李糖乳杆菌比例最高（80%），其次是发酵乳杆菌（60%）和加氏乳杆菌（60%），90%的SECC儿童口腔中检出3种或以上的LB。
  　  Teanpaisan和Thitasomakul等通过调查研究泰国某一地区的169个儿童的3、9、12、18、24个月口腔唾液中S.mutans和LB检出和龋损情况，发现在24个月儿童中S.mutans、LB检出率分别为86.98%和66.86%，且在1岁内（3、9、12个月）儿童中LB检出率明显高于S.mutans，这提示LB与早期龋损有一定关系。而24个月儿童随着口腔内LB的数量上升有更高的患龋风险，唾液中LB计数1~50CFU/1.5 cm2患龋风险为3.1%，＞50CFU/1.5 cm2为13.3%。
  　  在6岁以内有龋儿童口腔中和龋洞内可检测到LB的集聚，且随着龋病的进展，LB的数量也上升，而在无龋儿童口腔中很少检测到LB。龋病的发展开始于菌斑的附着，大量细菌附着于牙齿表面，利用糖代谢产酸，降低口腔环境的pH值，导致牙齿表面的脱矿。S.mutans定植于牙齿表面，为黏附性比较弱的LB提供定植的有利条件。早在1983年Burt等提出，S.mutans是窝沟龋的必要条件但不是充分条件。1994年Fitzgerald等已发现在继发龋中S.mutans与LB在致龋过程中有协同作用。
  　  2016年Neves等通过研究牙本质龋活动中细菌群的变化，发现双歧杆菌属和干酪乳杆菌在龋病活跃组织中比例明显高于无龋组织。而Anderson等研究发现与患龋儿童相比，在无龋儿童中乳杆菌、双歧杆菌和奈瑟氏菌更为常见。法国Muller-Bolla等通过对276个学校窝沟封闭儿童的3年追踪研究发现，对第一恒磨牙的窝沟封闭可以有效的减少口腔菌斑中LB、S.mutans的数目，进而降低儿童的患龋率。菌斑中的乳酸菌与S.mutans协同利用多糖分泌有机酸，主要为乳酸、乙酸、丙酸，使局部pH明显下降，当pH下降至临界值（一般为5.5）以下时，酸通过釉质晶体间的水、蛋白质和脂肪构成的扩散通道扩散进釉质，磷酸盐和羟基离子被氢离子取代，钙和磷酸盐等矿物离子丢失，晶体溶解。当口腔长期处于酸性环境，S.mutans和LB存在且大量产酸，局部pH长期位于临界值以下，釉质脱矿大于再矿化，最终导致彻底脱矿，晶体结构广泛崩溃，形成龋洞。

 　   2.乳酸杆菌的抑菌作用：
  　  根据国际科学协会对益生菌的官方定义：在宿主体内以充足的数量存活并对宿主有利的细菌，最常见的包括口腔内的LB和双歧杆菌。LB是一种普遍的益生菌，广泛存在于人类胃肠道、泌尿生殖系统，在调节局部微生物生态平衡中有重要地位。Caglar和Hatakka等研究表明，一些LB例如罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌产生的益生素或H2O2、抗真菌多肽能抑制其他口腔致病菌例如S.mutans以及念珠菌的生长。Ahola和Chuang等研究表明，口腔中的某些乳杆菌能降低口腔中S.mutans的水平。
   　 2015年Sidhu等研究发现，儿童长期摄入一定量的益生菌可以明显降低口内S.mutans的水平。益生菌例如双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌产生的益生素可以抑制口腔内致病菌的生长，从而抑制龋病、牙周病、口腔黏膜病的发展，但早期的研究并未阐明其具体机制。

 　   四、鉴定口腔内乳酸杆菌种类的研究方法
   　 鉴定LB的方法有多种选择，较早的方法是利用选择性培养基分离纯化鉴定LB的类型。另外，还可以在基因水平上鉴定LB种类，而鉴别LB特异菌株或特异基因型的分子生物学手段包括随机引物聚合酶链反应（arbitrarily primed polymerase chain reaction，AP-PCR）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、16SrRNA基因序列分析，用PCR结合限制酶切片段多态性分析（chromosomal DNA finger printing，CDF），核糖体基因分型、脉冲场凝胶电泳和重复性酶切片段分析等方法，其中以PCR为基础的DNA指纹技术可以从基因水平对LB的整体基因型进行检测，甚至可以进行菌株高度特异性的鉴定。而在这几年广泛应用发展的二代测序技术（The next gene ration sequencing technology，NGS）也极大的推动了微生物研究分析的发展。AP-PCR是一种通过随意设计或选择一个非特异性引物对在未知的目的基因序列模板进行扩增的技术。
   　 根据Walter等的研究报道，LB的AP-PCR引物为上游引物（Lac1）和下游引物（Lac2）筛选扩增的LB的16SrRNA基因片段，同时1个大小为40bp的GC发夹结构（5′-GCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACCGGGGG-′）连接在下游引物（Lac2）上，扩增出下一步适合DGGE电泳分析的PCR产物。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。NGS主要包括了454FLX、Illumina和Applied Biosystems SOLID system等技术平台。
   　 2016年Rôças等通过16SrRNA基因测序对10个不可复性牙髓炎的牙本质深龋坏样本进行分析，发现在属水平上，LB属约占菌群的42.3%，S.mutans约占5.5%，这也提示LB属与不可复性牙髓炎的发生密切相关。

  　  五、母亲与儿童龋病关系的研究现状
  　  早期龋病的致病菌来源除了食物、胃肠道还有其他感染人群的传播。有研究证据表明在中国或巴西的一些幼儿园的儿童间存在水平传播。2012年Teanpaisan等通过研究泰国181对母亲-儿童口腔S.mutans和LB的基因型分布，发现儿童口腔S.mutans和LB水平与母亲显著相关，而母亲-儿童口腔S.mutans和LB的基因型相同率分别为76%和50%，提出母亲与儿童之间存在着垂直传播关系。Caufield等通过研究15对母亲-儿童口腔LB基因型，发现只有23%的组具有相同的基因型，提出LB基因型相同的原因不仅是由于存在母子间垂直传播，也有可能通过相似的食物摄入。
   　 六、结论
  　  我国的5~12岁儿童患龋率还是偏高，口腔内的致龋菌群包括了S.mutans、LB和放线菌属等。那么LB作为一种口腔内长期且大量存在的细菌，既能够与链球菌一起协同致龋，又可通过分泌抑菌物质来抑制其他细菌的生长。对于LB的研究也逐渐的进入到基因分子水平，利用AP-PCR、CDF和DGGE技术通过对LB的16SrRNA基因片段的特异性分析，对口腔内LB的基因型进行特异性分析。
   　 七、展望
  　  LB在儿童龋齿发展中起重要作用，而龋病的发生又与儿童的饮食习惯、口腔卫生有极大的关系。虽然有个别的研究发现3~6岁的儿童与其母亲口腔内的LB基因型有一定的相关性，但是这些研究覆盖面不广，且也只描述了其相关性，而且国内研究甚为少见。因此，本文认为下一步应该在基因水平上对患龋儿童及其母亲口腔内LB种类的研究，另一方面也可进一步证明母亲与患龋儿童之间的垂直传播关系。